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标准操作程序STANDARD OPERA TING PROCEDURE目的：建立高效液相色谱仪检定规程，确保检验数据的准确性。
范围：本规程适用于配有紫外-可见光检测器、二级管阵列检测器、荧光检测器、示差折光率检测器和蒸发光散射检测器的液相色谱仪的首次检定、后续检定和使用中检查。
程序：1、为了证明仪器在日常使用的过程中，仪器本身或使用环境的变化（有意的和无意的）没影响仪器的整体性能，确保分析数据的可靠性。
2、本检定规程参照国家技术监督局JJG705-2014“液相色谱仪检定规程”以及USP1058“分析仪器确认”制订。
3、检定项目与要求3.1计量器具控制包括：首次检定、后续检定和使用中检验。
3.1.检定条件3.1.1.环境条件3.1.1.1.检定室应清洁无尘，无易燃、易爆和腐蚀性气体，排风良好。
3.1.1.2.仪器应平稳地放在工作台上，周围无强烈机械震动和电磁干扰源，仪器接地良好。
3.1.2.2. 分析天平: 最大称量不小于100g，最小分度值不大于1mg。
3.1.2.3. 数字温度计: 测量范围为0–100℃，最小分度不大于0.1℃。
3.1.4. 其他要求3.1.4.1. 检定用试剂：HPLC用甲醇、纯水，分析纯的丙酮和异丙醇等。
3.1.4.2. 其他玻璃器皿等4、检定程序4.1. 仪器外观仪器上应有仪器的名称、型号、制造厂名、产品系列号、出厂日期等内容的标牌，国产仪器应有制造计量器具许可证标志。
高效液相色谱仪校准规程发布时间：2016/4/23 14:38:32浏览次数：1162 (来源：东莞市世通仪器检测服务有限公司)高效液相色谱仪校准规程1.适合使用的范围适用于岛津LC-10AD型高效液相色谱仪的校准。
3.校准项目和技术方面的要求3.1.输液系统3.1.1.泵流量设定值误差：Ss＜2%；流量稳定性误差：＜2%3.1.2.定性测量重复性误差（5次定量管进样）：RSD≤1.5%3.1.3.定量测量重复性误差（5次定量管进样）：RSD≤1.5%3.2.紫外检测器性能3.2.1.可调波长紫外—可见光检测器波长示值误差：＜2nm；重复性误差：＜1nm3.2.2.基线.最小校准浓度（静态）：410-8g/ml（萘的甲醇溶液）4.校准条件4.1.环境温度为10～30℃，8小时内温度波动不超过3℃，相对湿度低于65%。
4.3.3.容量瓶4.3.4.微量注射器4.3.5.标准物质和试剂5.校准方法5.1.泵流量设定值误差Ss、流量稳定性误差S R的校准。
将仪器的输液系统、进样器、色谱柱和检测器联接好，以甲醇为液动相，按表1设定流量，待流速稳定后，在流动相排出口用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，准确地收集10～25分钟，称重，按下式计算Ss和S R。
Ss=（Fm—Fs）/Fs100%S R=（Fmax—Fmin）/F100%式中Ss为流量设定值误差（%）；Fm=（W2—W1）ρtt为流量实测值；W2：容量瓶+流动相的重量（g）；W1：容量瓶的重量（g）；Fs：流量设定值（ml/min）；ρt：实验温度下流动相的密度（g/cm3）；t：收集流动相的时间（min）；S R：流量稳定性误差（%）；Fmax：同一组测量中流量最大值（ml/min）；Fmin：同一组测量中流量最小值（ml/min）；F：同一组测量中的算术平均值（ml/min）。
2020版《中国药典》⾼效液相⾊谱法检验操作规程⼀、⽬的：制订详尽的⼯作程序，规范检验操作，保证检验数据的准确性。
三、职责：1、检验员：严格按操作规程操作，认真、及时、准确地填写检验记录；2、化验室负责⼈：监督检查检验员执⾏本操作规程。
四、内容：简述：⾼效液相⾊谱法系采⽤⾼压输液泵将规定的流动相泵⼊装有填充剂的⾊谱柱，对供试品进⾏分离测定的⾊谱⽅法。
注⼊的供试品，由流动相带⼊⾊谱柱内，各组分在柱内被分离，并进⼊检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理⾊谱信号。
1、对仪器的⼀般要求和⾊谱条件⾼效液相⾊谱仪由⾼压输液泵、进样器、⾊谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。
超⾼效液相⾊谱仪是耐超⾼压、⼩进样量、低死体积、⾼灵敏度检测的⾼效液相⾊谱仪。
1.1⾊谱柱1.1.1⾊谱柱的类型1.1.1.1反相⾊谱柱：以键合⾮极性基团的载体为填充剂填充⽽成的⾊谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常⽤的填充剂有⼗⼋烷基硅烷键合硅胶、⾟基硅烷键合硅胶和苯基硅烷键合硅胶等。
1.1.1.2正相⾊谱柱：⽤硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充⽽成的⾊谱柱。
1.1.2⾊谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表⾯积、键合基团的表⾯覆盖度、载体表⾯基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响⾊谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择正真适合的⾊谱柱。
1.1.3温度会影响分离效果，品种正⽂中未指明⾊谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
目的：本规程规定了高效液相色谱仪检定操作规程责任：由工程部制订、审核，质量保证部批准并颁发，工程部计量室执行。
内容：1.检定项目及技术方面的要求2. 检定条件2.1环境条件：仪器应放置在平稳的工作台上，室内温度15-30℃，相对湿度20%~85%RH范围内。
2.2 检定设备：秒表：分度值小于0.1秒分析天平：最大称量不小于100g,最小分度不大于1mg.数显测温仪:测量范围0~100℃，最小分度不大于0.1℃。
标准物质：萘/甲醇溶液、紫外溶液标准物质3. 检定方法3.1泵流量设定值误差、流量稳定性误差的检定将仪器的输液系统、进样器、色谱柱和检测器联好，以甲醇为流动相，设定流量，待流速稳定后，在流动相排口用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，准确收集相应时间，计算泵流量设宴定值误差S S和流量稳定性误差，结果按下式式中：F m—F m= (W2-W1)/(ρtt),为流量测定值（ml/min）—流量设定值误差（%）SSF S —流量设定值（ml/min）W1 —容量瓶重量（g）W2 —容量瓶＋流动相的重量（g）ρ—实验温度下流动相的密度（g/cm3）tt —收集流动相的时间（min）S R —流量稳定性误差（%）F max—同一组测量中流量最大值（ml/min）F min—同一组测量中流量最小值（ml/min）F—同一组测量值的算术平均值（ml/min）m3.2柱温箱温度控制管理系统的检定柱温箱温度的设定值误差ΔT与控温稳定性误差T C选择日常使用的单一温度进行检定，待指示温度稳定后，每隔10分钟记录一次，共计7次，求出算术平均值，设定值与平均值之差为ΔT，7次测量中最大与最小值之差为控温稳定性误差T C。
3.3检测器性能的检定检测波长为254nm，流动相为100%甲醇，流速为1.0ml/min，待基线分钟，计算基线nm，在相同波长下注入10~20uL 110-7g/ml的萘/甲醇溶液，记录色谱图，由色谱峰高和基线噪声峰-峰高，按下式计算最小检测浓度C L(按20uL进样量计算)。
高效液相色谱仪操作规程高效液相色谱仪（HPLC）是一种重要的分析仪器，大范围的应用于化学、生命科学、环境监视测定等领域。
为了保证色谱仪的正常运行和准确分析结果，需要遵守以下操作规程：1. 准备工作a. 首先，确保色谱仪及其附件的电源已接通，并确认仪器处于正常工作状态。
2. 样品制备和准备a. 样品应充分溶解并过滤净化，以避免样品中的杂质对色谱分离产生干扰。
b. 选择合适的进样方式（自动或手动），并根据进样方式调整进样器的参数。
5. 柱温控制a. 根据分析要选择合适的柱温，并使用温度控制系统保持恒定。
6. 检测器操作a. 根据需要选择正真适合的检测器，如紫外-可见光检测器（UV-Vis）、荧光检测器、电导检测器等。
b. 设置检测器的参数，如波长、增益和灵敏度，并进行基线. 数据采集与处理a. 启动数据采集系统，并设置采集参数，如采样率、数据类型和运行时间等。
8. 清洗和维护a. 实验结束后，关闭色谱柱和进样器的阀门，并用溶剂清洗色谱柱和进样器，以防止堵塞和降低杂质残留。
b. 清洗完成后，注意关闭色谱仪的电源，并按照要求对色谱柱和进样器进行维护和保养。
总结：高效液相色谱仪的操作规程包括准备工作、样品制备、进样器操作、色谱柱准备、柱温控制、检测器操作、数据采集与处理以及清洗与维护等。
本文将介绍一种高效液相色谱仪校验方案，旨在提供一套操作规范，以确保HPLC的正常工作。
二、校验前准备在进行HPLC校验前，需要进行以下准备工作：1.确保校验设备和试剂的准备和到位。
2.检查HPLC仪器各部件是否完好无损，如进样器、流动相泵、检测器等是否正常工作。
三、校验项目及方法1. 流动相流速校验项目描述流动相的流速是HPLC分析的重要参数，需保证其准确性和稳定性。
校验方法1.用高精度天平称取准确质量的校验溶液，在恒温条件下，通过进样器将校验溶液输入到流动相泵中。
2. 进样量校验项目描述进样量是HPLC分析中的重要参数，需要准确控制。
3. 峰面积校验项目描述峰面积是HPLC分析结果的一个重要参数，可用于定量分析。
四、结果与讨论根据校验所得数据，可以计算相对偏差和标准差，并与厂家提供的规格要求进行比较。
如果相对偏差和标准差均在规定范围内，说明HPLC仪器的性能良好，可以继续使用。
五、结论通过本校验方案的实施，可以对HPLC仪器的流动相流速、进样量和峰面积进行有效校验，确保仪器的准确性和稳定性。
2、范围Scope ：本规程适用于本公司使用的高效液相色谱仪（紫外-可见光检测器/二极管阵列检测器）的校验。
3、职责Responsibilities：3.1 培训职责：本文件起草人或审核人或批准人负责对质量管理部全体人员培训。
5、程序Procedures：5.1 依据国家计量校验规程JJG 705-2002液相色谱仪，安捷伦液相说明书，岛津液相说明书。
5.2.11 热电偶5.3 校验项目及技术指标5.3.1泵性能的测试5.3.2柱温箱温度稳定性测试*备注：如药典专论规定的特定柱温，不在以上温度范围之内，则对分析该品种的仪器增加该温度点校验，校验项目和可接受指标相同。
5.3.3 检测器性能测试5.3.4进样器性能测试5.3.5梯度组成的测试*注：*表示该项目的内部校验取决于仪器的配置，有该配置则为必检项目。
5.4 校验方法5.4.1校验通则5.4.1.1 HPLC的内部校验由仪器所属部门经培训的使用者按本规程进行校验，其校验项目依仪器配置和使用范围而定。
5.4.1.2 政府部门每一年对HPLC进行校验，每六个月内部对HPLC进行一次校验；仪器配置的关键部件大修或更换后，可参考本规程对该部件相关的项目进行校验，以对仪器的性能进行确认。
此种仪器在使用过程中，难免会出现各种各样的问题，并将直接影响到所测数据的准确性和仪器的正常工作。
操作者如果能了解故障的成因，即可清楚预防和排除这些故障的方法，就可正确地使用仪器并最大限度地发挥仪器的性能。
今天我们要从以下几个方面和您分享下在使用高效液相色谱仪中需注意的几个问题。
高效液相色谱分析法是一个很灵敏的分析方法，如果因使用不洁净的试管，便会影响试验结果的准确性。
例如，在用甲醇作溶剂来溶解样品时，所用的小试管是用橡胶塞来做盖子的，因此，在每次进样时，都有一个保留时间固定的干扰峰存在，后经证实，此干扰峰是由甲醇浸泡橡胶塞而溶下的组分所产生，换用玻璃试管后，干扰峰消除。
近年来，一次性塑料试管给试验人员带来了极大的方便，但是，在使用过程中一定要注意有机溶剂对试管的溶解现象，在利用此种试管提取样品时，有些有机溶剂(如氯仿等)对管壁有溶解现象，这些被溶解下来的物质有时也能在检测器上产生信号，从而干扰样品的测定。
这时，可用相同的实验条件先行试验一下，看看不含被抽提物时，提取液在检测器上能否产生干扰信号，如确有干扰信号存在，就只能换用耐有机溶剂的玻璃试管了。
这个问题也应引起注意，否则也会影响测试结果的准确性，在治疗药物监测(Therapeutic Drug Monitoring,TDM)中，有些被测药物如阿米替林，丙咪嗪等易吸附在玻璃试管的管壁上，因此，操作中宜采用聚丙烯管，为防止提取中吸附现象的发生，可采用0. 5%的已二胺已烷液做为提取剂，可有效地防止吸附。
二、操作进样阀的问题目前，在分析型高效液相色谱仪中常用的进样阀是7725型进样阀，其内部的六通阀结构使进样操作非常方便，但是，如果使用不当，也会带来问题。
例如，在高效液相色谱法的试验过程中，有时会有异常色谱峰的出现以及重现性不好的问题，这主要是由于操作方法不当所引起，要想解决此类问题，需从以下几个方面入手。
二、引用标准：中华人民共和国药典（2000年版二部附录）三、仪器的组成和一般要求：1、仪器的组成：高压输液泵；色谱柱；检测器；积分仪；打印机。
常用的色谱柱填充剂有硅胶和化学健合硅胶，后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用。
离子交换填充剂用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂用于分子排阻色谱等。
在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符合紫外分光光度法（药典2000年版附录IV A）项下对溶剂的要求。
正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。
2.1 紫外分光光度法项下对溶剂的要求：用1cm石英吸收池盛溶剂，以空气为空白（即空白光路中不置任何物质），测定其吸收度。
四、系统适用性试验按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求，或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。
1、色谱柱的理论板数（n）在先定的条件下，注入供试品溶液或品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间t R（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和半峰高宽（W h/2），按n=5.54（t R/W h/2）2计算色谱柱的理论板数。
三、职责：1、检验员：严格按操作规程操作，认真、及时、准确地填写检验记录；2、化验室负责人：监督检查检验员执行本操作规程。
四、内容：简述：高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1、对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。
超高效液相色谱仪是耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。
1.1色谱柱1.1.1色谱柱的类型1.1.1.1反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基硅烷键合硅胶等。
1.1.1.2正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
1.1.2色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择正真适合的色谱柱。
1.1.3温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
1.1.4残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在2～8之间。
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. ... ..标准文件1、目的Objective：建立高效液相色谱仪部校验规程，确保校验工作规、顺利进行。
2、围Scope ：本规程适用于本公司使用的高效液相色谱仪（紫外-可见光检测器/二极管阵列检测器）的校验。
3、职责Responsibilities：3.1 培训职责：本文件起草人或审核人或批准人负责对质量管理部全体人员培训。
5、程序Procedures：5.1 按照国家计量校验规程JJG 705-2002液相色谱仪，安捷伦液相说明书，岛津液相说明书。
5.2.11 热电偶5.3 校验项目及技术指标5.3.1泵性能的测试表15.3.2柱温箱温度稳定性测试*表2备注：如药典专论规定的特定柱温，不在以上温度围之，则对分析该品种的仪器增加该温度点校验，校验项目和可接受指标相同。
5.3.3 检测器性能测试表35.3.4进样器性能测试表45.3.5梯度组成的测试*注：*表示该项目的部校验取决于仪器的配置，有该配置则为必检项目。
5.4 校验方法5.4.1校验通则5.4.1.1 HPLC的部校验由仪器所属部门经培训的使用者按本规程进行校验，其校验项目依仪器配置和使用围而定。
5.4.1.2 政府部门每一年对HPLC进行校验，每六个月部对HPLC进行一次校验；仪器配置的核心部件大修或更换后，可参考本规程对该部件相关的项目进行校验，以对仪器的性能进行确认。
5.4.1.3 校验时，同时检查、确认仪器的安装，使用环境符合标准要求，仪器处于正常的状态下，并检查、确认仪器的接线 不同配置的仪器，须依规定的校验项目及指标进行部校验，以保证该仪器的所有使用功能均进行了校验。
5.4.2 泵性能的测试－S S和S R的测定5.4.2.1 测试条件：流动相：水；色谱柱：限流阻尼管。
待流速稳定后，在流动相流出口处用容量瓶准确地收集流动相10.0ml，同时用秒表计时，各测量3次，按公式(1)、(2)计算S S和S R，并以下表所列容记录测试数据和结果。
表6 泵性能的测试5.4.3柱温箱温度稳定性测试—△T 和Tc的校验5.4.3.1测试将测温仪之热电偶固定在柱温箱中央，关好柱箱门。
以限流阻尼管替代色谱柱，分别设定柱温箱温度为20℃，25℃，30℃，35℃，40℃等值进行校验，这些温度覆盖了实验室使用的柱温围。
待测温仪指示温度稳定后，记录温度显示值，每隔5分钟测一次，每个温控点测定1小时，求出平均值，并以下表所列容记录测试数据和结果。
设定值与平均值之差为设定值误差△T，13次测量值中最大值与最小值之差为控温稳定性误差Tc。
计算方法：漂移值＝图谱单位距离对应的吸光度AUL/0.5h。
5.4.4.2 波长准确度的测试5.4.4.2.1 DAD/PDA的测试取标样2)进样，记录色谱图和200nm～400nm围的紫外吸收图谱，其205nm 处的最大吸收处波长与205nm比较，其273nm处的最大吸收处波长与273nm比较，最小吸收处的波长与245nm比较，三波长处的差值△λ均应≤2nm。
5.4.4.2.2 UV检测器的测试a.具备紫外图谱扫描功能的检测器：以水流过流通池时作一空白扫描，然后，以手动方式将标样2)注入流通池，扫描200nm～300nm围的紫外吸收图谱。
记录最大吸收和最小吸收处的波长，其205nm处的最大吸收波长与205nm比较，其273nm 处的最大吸收波长与273nm比较，最小吸收波长与245nm比较，三波长处的差值△λ均应≤2nm。
b.不具备紫外图谱扫描功能的检测器：以水注入流通池调零，然后，将标样2)注入流通池，通过设定不同波长，记录205nm、245nm、273nm三个波长上下各5个nm围的吸收度A或流通池参比能量R与样品能量S的比值，205nm、273nm波长处各取该波长围最大的吸收值或比值对应的波长为测定波长；245nm波长处取该波长围最小的吸收值或比值对应的波长为测定波长。
测定波长分别与对应的波长205nm、245nm、273nm比较，三波长处的差值△λ均应≤2nm。
b．测试待系统平衡后，分别取标样1)、2)、3)、4)、5)、6)，手动进样器依仪器配置之定量环的体积进样，记录色谱图。
以标样浓度Ci为横坐标，以峰面积Ai为纵坐标作线性回归，得其线性方程及相关系数R。
b.测试取标样5)（浓度为0.125mg/ml），自动进样器以5μl，10μl，20μl的体积各连续进样6次；手动进样器依仪器配置之定量环的体积连续进样6次，记录色谱图，以峰的保留时间和峰面积，按公式(3)计算相对标准偏差RSD，并以下表所列容记录测试数据和结果。
b．测试取标样3)（浓度为0.025mg/ml），分别以5μl，10μl，15μl，20μl，25μl 的体积进样，记录色谱图。
以进样体积V i为横坐标，以峰面积A i为纵坐标作线性回归，得其线性方程及相关系数R。
对各进样体积对应的响应因子f i进行数理统计，按公式（3）计算其RSD。
5.4.6 梯度组成测试5.4.6.1 测试条件流速：2.0ml/min；流动相1：水；流动相2：0.5% 丙酮的水溶液；检测波长：265nm；色谱柱：限流阻尼管。
5.4.6.2 测试以限流阻尼管替代色谱柱，以流动相1平衡系统，通道A、B匹配（或通道C、D匹配），按下表之梯度程序，平行测试3次，记录色谱图。
将色谱图按0%到100%B（或D）重新标定刻度，以测定每个梯级的理论高度（TSH）与实测高度（MSH），见图1“梯度组成准确度示意图”，其差值（TSH-MSH）即为准确度，以%B（或D）单位表示。
取3次测定中50.0%B、6.0%B和5.0%B（或D）等值的准确度进行数理统计，计算其准确度的精密度SD。
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